遠(yuǎn)慕解答: 細(xì)胞培養(yǎng)常見問答!

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一、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)和步驟
　　細(xì)胞培養(yǎng)基大全
　　細(xì)胞原代培養(yǎng)步驟
　　細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟
　　二、細(xì)胞培養(yǎng)常見問答
　　1、加到培養(yǎng)基中的血清 必須滅活嗎？
　　答：不是必須的，看做什么實(shí)驗(yàn)了。
　　2、四季青胎牛血清滅活是56 ℃30分鐘嗎？
　　答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長(zhǎng)因子 。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，血清是需要滅活，一般是56 ℃，30 min。
　　3、我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？
　　答：進(jìn)口的一般都已滅活，國(guó)產(chǎn)的不一定，最hao還是滅活一下再用較安全。

　　4、我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體 ，是不是會(huì)影響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體 補(bǔ)體可能會(huì)和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染，正確嗎？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67 收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)，目的是什么？
　　答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對(duì)病毒和宿主結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活！這要根據(jù)實(shí)際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。
　　5、(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制 液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？
　　答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭(zhēng)議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，因?yàn)橛袃蓚€(gè)作用，是滅活補(bǔ)體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子 、氨基酸 等成分帶來的負(fù)面影響。
　　我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時(shí)候，有一次水浴 箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80 ℃，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56 ℃下滅活半小時(shí)以上，肯定也會(huì)對(duì)里面的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會(huì)我做個(gè)延長(zhǎng)滅活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，這常常會(huì)被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗(yàn)證到底有沒有污染，常常又會(huì)把血清放置37 ℃溫育，但是血清中的蛋白會(huì)進(jìn)一步析出，最后還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn)，和革蘭氏染色試驗(yàn)，非常麻煩。
　　我看過一份資料，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45 ℃到62 ℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最chang用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。
　　有人比較過11個(gè)不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6 個(gè)細(xì)胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5)的生長(zhǎng)帶來負(fù)面影響，三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè)細(xì)胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的促進(jìn)作用。
　　你可以摸索一下，血清從-20 ℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對(duì)細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個(gè)過程最多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮血清滅活與否對(duì)你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。
　　(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？
　　答：正常。
　　6、如何選用培養(yǎng)基？
　　培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(zhǎng)。總之，shou選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的shou選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。
　　7、為什么要熱滅活血清？
　　加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。
　　8、L－在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
　　L－在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L－可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。
　　9、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
　　GlutaMAX-I二肽是L－的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－幾乎降解。
　　10、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
　　酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基
　　11、如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？
　　用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200－2 000個(gè)/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。
　　12、如何消除組織培養(yǎng)的污染？
　　當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。
　　1） 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
　　2 ）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
　　3 ）每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
　　4 ）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。
　　5 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
　　6 ）重復(fù)步驟4。
　　7 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。
　　13、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
　　丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。
　　14、為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀？
　　GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2－8 ℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在－20 ℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。
　　15、目錄上說，Hank's （HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？ Hank's （HBS）和Earle's（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？
　　HBS和 EBS 的主要差別在于的水平，的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。
　　16、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
　　Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測(cè)： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌體檢驗(yàn) 生物化學(xué)檢測(cè) 激素的檢測(cè) 血紅蛋白檢測(cè) Sf9 細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)及方法學(xué)檢測(cè)
　　17、二價(jià)離子抑制活性嗎？使用時(shí)加入EDTA的目的是什么？
　　二價(jià)離子的確抑制活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制的活性。建議處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。
　　18、制備 lipid-DNA的方法會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率嗎？
　　是的。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100 μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對(duì)于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800 μl）。（注意以上是35 mm培養(yǎng)皿使用體積）。對(duì)于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個(gè)很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對(duì)于每一種脂質(zhì)體的詳細(xì)的信息可以參考產(chǎn)品說明書。
　　19、我使用SF900 Ⅱ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時(shí)效果好？
　　如果目的蛋白是一個(gè)后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會(huì)作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯1底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。
　　20、如何檢測(cè)內(nèi)毒素(熱源)水平？
　　LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動(dòng)一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。 胎牛血清的內(nèi)毒素檢測(cè)是在Grand Island，按照手冊(cè)上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對(duì)血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會(huì)抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）
　　21、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？
　　如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。
　　22、20 ℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會(huì)改變嗎？
　　對(duì)于普通使用的緩沖液，pH值隨溫度變化而變化。
　　24、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的PH值和滲透壓是多少？
　　生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH值對(duì)細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會(huì)產(chǎn)生影響。對(duì)于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時(shí)，培養(yǎng)基的滲透壓是 345－380 mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。
　　25、High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？
　　High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。