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微生物限度檢測是評估藥品、食品等產品中微生物污染程度的重要方法，其操作步驟需嚴格遵循無菌原則和標準化流程。以下是綜合多個來源的核心操作步驟及技術要點：
一、前期準備環境與設備 - 檢測需在萬級潔凈室內的百級層流超凈工作臺進行，定期驗證環境沉降菌（≤1 CFU/皿）和壓差。
- 儀器（如微生物限度檢測儀、離心機）及玻璃器皿（平皿、吸管等）需提前滅菌處理。
試劑與培養基 - 配制稀釋液（如pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液）及培養基（營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂等），經121℃高壓滅菌后備用。
人員與防護 - 操作者需穿戴無菌服、口罩、手套，手部用75%乙醇消毒，實驗過程中嚴格避免交叉污染。
二、樣品處理取樣要求 - 隨機抽取≥3倍檢驗量的樣品，固體取10g、液體取10ml，膜劑需≥4片或100cm2。
供試液制備 - 常規樣品：固體研磨后加稀釋液制成1:10供試液；液體直接稀釋或原液檢測。
- 特殊樣品：
- 油脂類：加入無菌十四烷酸異丙酯或聚山梨酯80乳化后稀釋。
- 抑菌性樣品：采用薄膜過濾法（如抗生素類）或中和劑處理。
三、接種與培養細菌/霉菌計數 - 平皿法：取供試液1ml注入無菌平皿，傾注45℃以下融化的培養基（營養瓊脂用于細菌，玫瑰紅鈉瓊脂用于霉菌/酵母菌），搖勻后凝固培養。
- 薄膜過濾法：供試液經濾膜過濾后沖洗（總沖洗量≤1000ml），濾膜貼于培養基表面培養，適用于抑菌性樣品。
控制菌檢查 - 如大腸埃希菌、沙門氏菌等，采用增菌培養（膽鹽乳糖培養基）→分離培養（選擇性瓊脂）→生化鑒定的步驟。
培養條件 - 細菌：30-35℃培養3-5天；霉菌/酵母菌：23-28℃培養5-7天。
四、結果觀察與分析菌落計數 - 使用菌落計數器或顯微鏡觀察，記錄各稀釋級的菌落數，以平均菌落數計算CFU/g或CFU/ml。
控制菌判定 - 陽性對照需檢出目標菌，陰性對照無菌生長，否則實驗無效。
五、方法學驗證回收率試驗 - 加入標準菌株（如金黃色葡萄球菌、黑曲霉），驗證樣品抑菌性是否消除，回收率需≥70%。
方法選擇依據 - 根據樣品特性選擇常規法、培養基稀釋法或薄膜過濾法，確保檢測結果準確。
六、注意事項- 實驗全程需無菌操作，避免二次污染。
- 抑菌性樣品需優先采用薄膜過濾法或離心集菌法處理。
- 定期對培養基進行適用性檢查（如促生長試驗）。
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發表于 2025-2-20 14:48:12
